Il-velenu tas-serp fih enżimi li idrolizzaw il-bonds tal-esteri karbossiliċi.Is-sottostrati għall-idroliżi huma fosfolipidi, aċetilkolina u aċetat aromatiku.Dawn l-enzimi jinkludu tliet tipi: phospholipase, acetylcholinesterase u aromatic esterase.Arginine esterase fil-velenu tas-serp jista 'wkoll idrolizza l-arginine sintetiku jew il-lisina, iżda prinċipalment idrolizza bonds ta' proteina peptide fin-natura, għalhekk jappartjeni għal protease.L-enzimi diskussi hawn jaġixxu biss fuq sottostrati tal-ester u ma jistgħux jaġixxu fuq xi rabta peptide.Fost dawn l-enzimi, il-funzjonijiet bijoloġiċi ta 'acetylcholinesterase u phospholipase huma aktar importanti u ġew studjati bis-sħiħ.Xi veleni tas-serp għandhom attività aromatika esterase qawwija, li tista 'tidrolizza p-nitrophenyl ethyl ester, a - jew P-naphthalene acetate u indole ethyl ester.Għadu mhux magħruf jekk din l-attività hijiex prodotta minn enzima indipendenti jew effett sekondarju magħruf ta 'carboxilesterase, aħseb u ara s-sinifikat bijoloġiku tagħha.Meta l-velenu ta 'Agkistrodon halys Japonicus ġie reaġit b'p-nitrophenyl ethyl ester u indole ethyl ester, l-idrolisati ta' p-nitrophenol u indole phenol ma nstabux;Għall-kuntrarju, jekk dawn l-esteri jirreaġixxu mal-velenu tas-sriep tas-sottospeċi cobra Zhoushan u l-velenu tas-serp Bungarus multicinctus, ikunu idrolizzati malajr.Huwa magħruf li dawn il-veleni tal-kobra għandhom attività qawwija ta 'cholinesterase, li tista' tkun responsabbli għall-idroliżi tas-sottostrati ta 'hawn fuq.Fil-fatt, Mclean et al.(1971) irrappurtaw li ħafna veleni tas-serp li jappartjenu għall-familja Cobra jistgħu idrolizzaw indole ethyl ester, naphthalene ethyl ester u butyl naphthalene ester.Dawn il-veleni tas-serp ġejjin minn: cobra, cobra għonq iswed, cobra lipped iswed, cobra golden, cobra Eġizzjana, cobra king, golden cobra mamba, black mamba u white lipped mamba (D. aw għadu jaf ir-rattlesnake tal-Lvant tar-rhombola
Il-velenu tas-serp jista 'jidrolizza l-ester etiliku tal-metil indol, li huwa s-sottostrat għad-determinazzjoni tal-attività tal-cholinesterase fis-serum, iżda dan il-velenu tas-serp ma jurix attività ta' cholinesterase.Dan juri li hemm esterase mhux magħruf fil-velenu tal-kobra, li huwa differenti mill-cholinesterase.Biex tifhem in-natura ta 'din l-enzima, huwa meħtieġ aktar xogħol ta' separazzjoni.
1、 Phospholipase A2
(I) Ħarsa ġenerali
Phospholipase hija enzima li tista 'tidrolizza l-glyceryl phosphate.Hemm 5 tipi ta 'fosfolipasi fin-natura, jiġifieri fosfolipasi A2 u fosfolipasi
A. , phospholipase B, phospholipase C u phospholipase D. Il-velenu tas-serp prinċipalment fih phospholipase A2 (PLA2), ftit veleni tas-sriep fihom phospholipase B, u fosfolipasi oħra jinsabu prinċipalment f'tessuti u batterji tal-annimali.Fig. 3-11-4 turi s-sit ta 'azzjoni ta' dawn il-fosfolipasi fuq l-idroliżi tas-sottostrat.
Fost il-fosfolipasi, PLA2 ġie studjat aktar.Jista 'jkun l-aktar enzima studjata fil-velenu tas-serp.Is-sottostrat tiegħu huwa r-rabta ester fuq it-tieni pożizzjoni ta 'Sn-3-glycerophosphate.Din l-enzima tinstab ħafna fil-velenu tas-serp, il-velenu tan-naħal, il-velenu tal-iskorpjun u t-tessuti tal-annimali, u PLA2 huwa abbundanti f'erba 'veleni tas-serp tal-familja.Minħabba li din l-enzima tkisser iċ-ċelluli ħomor tad-demm u tikkawża l-emolisi, tissejjaħ ukoll "hemolysin".Xi nies isejħu wkoll PLA2 hemolytic lecithinase.
Ludeeke l-ewwel sab li l-velenu tas-serp jista 'jipproduċi kompost emolitiku billi jaġixxi fuq il-leċitina permezz ta' enżimi.Aktar tard, Delezenne et al.wera li meta l-velenu tal-kobra jaġixxi fuq is-serum jew l-isfar taż-żwiemel, jifforma sustanza emolitika.Issa huwa magħruf li PLA2 jista 'jaġixxi direttament fuq il-fosfolipidi tal-membrana tal-eritroċiti, jeqred l-istruttura tal-membrana tal-eritroċiti u jikkawża emolisi diretta;Jista 'wkoll jaġixxi fuq serum jew leċitina miżjuda biex tipproduċi leċitina emolitika, li taġixxi fuq iċ-ċelluli ħomor tad-demm biex tipproduċi emolisi indiretta.Għalkemm PLA2 huwa abbundanti fl-erba 'familji ta' veleni tas-serp, il-kontenut ta 'enzimi f'diversi veleni ta' serp huwa kemmxejn differenti.Rattlesnake (C
Il-velenu tas-serp wera biss attività PLA2 dgħajfa.Tabella 3-11-11 turi t-tqabbil tal-attività PLA2 ta '10 veleni ewlenin ta' sriep velenużi fiċ-Ċina.
Tabella 3-11-11 Tqabbil tal-attivitajiet tal-fosfolipasi VIII ta’ 10 veleni tas-serp fiċ-Ċina
Velenu tas-serp
Rilaxx tax-xaħam
Aċidu alifatiku,
Cjumol/mg)
Attività emolitika CHU50/^ g * ml)
Velenu tas-serp
Irrilaxxa l-aċidi grassi
(^raol/mg)
Attività emolitika "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
ħdax
Micracephal ophis
ħames punt wieħed żero
kalyspallas
8. 68
elfejn u tmien mija
gracilis
V, akutus
7. 56
** #
Ophiophagus hannah
tliet punt tmienja tnejn
mija u erbgħin
Bnugarus fasctatus
7,56
mitejn u tmenin
B. multicinctus
punt disa sitta
mitejn u tmenin
Viper a russelli
seba punt żero tlieta
T, mucrosquamatos
punt tmienja ħamsa
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Separazzjoni u purifikazzjoni
Il-kontenut ta 'PLA2 fil-velenu tas-serp huwa kbir, u huwa stabbli għas-sħana, aċidu, alkali u denaturant, sabiex ikun faċli biex tippurifika u tissepara PLA2.Il-metodu komuni huwa li l-ewwel twettaq filtrazzjoni tal-ġell fuq il-velenu mhux raffinat, imbagħad twettaq kromatografija ta 'skambju joniku, u l-pass li jmiss jista' jiġi ripetut.Għandu jiġi nnutat li t-tnixxif bil-friża ta 'PLA2 wara kromatografija ta' skambju ta 'joni m'għandux jikkawża aggregazzjoni, minħabba li l-proċess ta' friżar ta 'spiss iżid is-saħħa jonika fis-sistema, li hija fattur importanti li jikkawża l-aggregazzjoni ta' PLA2.Minbarra l-metodi ġenerali ta 'hawn fuq, ġew adottati wkoll il-metodi li ġejjin: ① Wells et al.② L-analogu tas-sottostrat ta 'PLA2 intuża bħala ligand għall-kromatografija ta' affinità.Dan il-ligand jista 'jorbot ma' PLA2 fil-velenu tas-serp b'Ca2+.L-EDTA jintuża l-aktar bħala elwent.Wara li jitneħħa Ca2 +, l-affinità bejn PLA2 u ligand tonqos, u tista 'tiġi dissoċjata mil-ligand.Oħrajn jużaw 30% soluzzjoni organika jew 6mol/L urea bħala elwent.③ Il-kromatografija idrofobika saret b'PheiylSephar0SeCL-4B biex tneħħi traċċa PLA2 fil-kardjotossina.④ Antikorp anti PLA2 intuża bħala ligand biex iwettaq kromatografija ta 'affinità fuq PLA2.
S'issa, numru kbir ta 'velenu tas-serp PLAZ ġew ippurifikati.Tu et al.(1977) elenkaw PLA2 purifikat mill-velenu tas-serp qabel l-1975. F'dawn l-aħħar snin, numru kbir ta 'artikoli dwar separazzjoni u purifikazzjoni ta' PLA2 ġew irrappurtati kull sena.Hawnhekk, aħna niffukaw fuq is-separazzjoni u l-purifikazzjoni tal-PLA minn studjużi Ċiniżi.
Chen Yuancong et al.(1981) isseparaw tliet speċi PLA2 mill-velenu ta 'Agkistrodon halys Pallas f'Zhejiang, li jistgħu jinqasmu fi PLA2 aċidużi, newtrali u alkalini skond il-punti iżoelettriċi tagħhom.Skont it-tossiċità tiegħu, PLA2 newtrali huwa aktar tossiku, li ġie identifikat bħala newrotossina presinaptic Agkistrodotoxin.PLA2 alkalin huwa inqas tossiku, u PLA2 aċiduż kważi m'għandu l-ebda tossiċità.Wu Xiangfu et al.(1984) qabblu l-karatteristiċi ta 'tliet PLA2s, inkluż piż molekulari, kompożizzjoni ta' aċidu amminiku, N-terminal, punt iżoelettriku, stabbiltà termali, attività ta 'enżimi, tossiċità u attività emolitika.Ir-riżultati wrew li kellhom piż molekulari u stabbiltà termali simili, iżda kellhom differenzi sinifikanti f'aspetti oħra.Fl-aspett tal-attività tal-enżimi, l-attività tal-enzima aċiduża kienet ogħla mill-attività tal-enzima alkalina;L-effett emolitiku ta 'enżima alkalina fuq ċelluli ħomor tad-demm tal-firien kien l-aktar b'saħħtu, segwit minn enzima newtrali, u enzima aċiduża bilkemm emolyzed.Għalhekk, huwa spekulat li l-effett emolitiku ta 'PLAZ huwa relatat mal-ħlas tal-molekula PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) għamlu kristalli Agkistrodotoxin.Tu Guangliang et al.(1983) irrappurtaw li PLA tossiku b'punt iżoelettriku ta '7. 6 kien iżolat u ppurifikat mill-velenu ta' Vipera rotundus minn Fujian, u l-proprjetajiet fiżiċi u kimiċi tiegħu, kompożizzjoni ta 'aċidu amminiku u s-sekwenza ta' 22 residwi ta 'aċidu amminiku fl-N -terminal ġew determinati.Li Yuesheng et al.(1985) iżolat u purifikat PLA2 ieħor mill-velenu ta 'Viper rotundus f'Fujian.Is-subunità tal-PLA2 * hija 13 800, il-punt iżoelettriku huwa 10.4, u l-attività speċifika hija 35/xnioI/miri mg。 Bil-leċitina bħala s-sottostrat, il-pH ottimali tal-enzima huwa 8.0 u t-temperatura ottimali hija 65 ° C LD5 injettat ġol-vini fil-ġrieden.Huwa 0.5 ± 0.12mg/kg.Din l-enzima għandha effetti antikoagulanti u emolitiċi ovvji.Il-molekula PLA2 tossika tikkonsisti minn 123 residwu ta '18-il tip ta' aċidi amminiċi.Il-molekula hija rikka fiċ-ċisteina (14), l-aċidu aspartiku (14) u l-gliċina (12), iżda fiha biss methionine waħda, u N-terminal tagħha huwa residwu tas-serina.Meta mqabbel ma 'PLA2 iżolat minn Tuguang, il-piż molekulari u n-numru ta' residwi ta 'aċidu amminiku taż-żewġ isoenzimi huma simili ħafna, u l-kompożizzjoni tal-aċidu amminiku hija wkoll simili ħafna, iżda n-numru ta' residwi ta 'aċidu aspartiku u proline huwa kemmxejn differenti.Il-velenu tas-serp tal-Cobra tar-Re ta 'Guangxi fih PLA2 għani.Shu Yuyan et al.(1989) iżolat PLA2 mill-velenu, li għandu attività speċifika 3.6 darbiet ogħla mill-velenu oriġinali, piż molekulari ta '13000, kompożizzjoni ta' 122 residwi ta 'aċidu amminiku, punt iżoelettriku ta' 8.9, u stabbiltà termali tajba.Mill-osservazzjoni tal-mikroskopju elettroniku tal-effett tal-PLA2 bażiku fuq iċ-ċelluli ħomor tad-demm, wieħed jista 'jara li għandu effett ovvju fuq il-membrana taċ-ċelluli ħomor tad-demm tal-bniedem, iżda m'għandu l-ebda effett ovvju fuq iċ-ċelluli ħomor tad-demm tal-mogħoż.Dan il-PLA2 għandu effett ta 'ritard ovvju fuq il-veloċità elettroforetika taċ-ċelluli ħomor tad-demm fil-bnedmin, il-mogħoż, il-fniek u l-fniek tal-Indi.Chen et al.Din l-enzima tista 'tinibixxi l-aggregazzjoni tal-plejtlits indotta minn ADP, kollaġen u aċidu arakidoniku tas-sodju.Meta l-konċentrazzjoni PLA2 hija 10/xg/ml ~ lOOjug/ml, l-aggregazzjoni tal-plejtlits hija kompletament inibita.Jekk il-plejtlits maħsula intużaw bħala materjali, PLA2 ma setax jinibixxi l-aggregazzjoni fil-konċentrazzjoni ta '20Mg/ml.L-aspirina hija inibitur ta 'cyclooxygenase, li jista' jinibixxi l-effett ta 'PLA2 fuq il-plejtlits.PLA2 jista 'jinibixxi l-aggregazzjoni tal-plejtlits billi idrolizza l-aċidu arakidoniku biex jissintetizza thromboxane A2.Il-konformazzjoni tas-soluzzjoni ta 'PLA2 prodotta mill-velenu ta' Agkistrodon halys Pallas fil-Provinċja ta 'Zhejiang ġiet studjata permezz ta' dichroism ċirkolari, fluworexxenza u assorbiment UV.Ir-riżultati sperimentali wrew li l-konformazzjoni tal-katina prinċipali ta 'din l-enzima kienet simili għal dik tal-istess tip ta' enzima minn speċi u ġeneri oħra, il-konformazzjoni tal-iskeletru kellha reżistenza tajba għas-sħana, u l-bidla strutturali fl-ambjent tal-aċidu kienet riversibbli.Il-kombinazzjoni ta 'attivatur Ca2+ u enzima ma taffettwax l-ambjent tar-residwi tat-triptofan, filwaqt li l-inibitur Zn2+ jagħmel l-oppost.Il-mod li bih il-valur tal-pH tas-soluzzjoni jaffettwa l-attività tal-enzima huwa differenti mir-reaġenti ta 'hawn fuq.
Fil-proċess ta 'purifikazzjoni PLA2 tal-velenu tas-serp, fenomenu ovvju huwa li velenu tas-serp fih żewġ qċaċet ta' elużjoni PLA2 jew aktar.Dan il-fenomenu jista 'jiġi spjegat kif ġej: ① minħabba l-eżistenza ta' isozymes;② Tip wieħed ta 'PLA2 huwa polimerizzat f'varjetà ta' taħlitiet PLA2 b'diversi piżijiet molekulari, li ħafna minnhom huma fil-medda ta '9 000 ~ 40 000;③ Il-kombinazzjoni ta 'PLA2 u komponenti oħra tal-velenu tas-serp tikkomplika PLA2;④ Minħabba li r-rabta amide fil-PLA2 hija idrolizzata, il-ħlas jinbidel.① U ② huma komuni, bi ftit eċċezzjonijiet biss, bħal PLA2 fil-velenu tas-serp CrWa/w
Hemm żewġ sitwazzjonijiet: ① u ②.It-tielet kundizzjoni nstabet fil-PLA2 fil-velenu tas-sriep li ġejjin: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, viper Palestinjan, viper tar-ramel, u rattlesnake terribbli km。
Ir-riżultat tal-każ ④ jagħmel il-veloċità tal-migrazzjoni tal-PLA2 tinbidel waqt l-elettroforeżi, iżda l-kompożizzjoni tal-aċidu amminiku ma tinbidilx.Il-peptidi jistgħu jitkissru bl-idroliżi, iżda ġeneralment għadhom magħqudin flimkien b'rabtiet disulfide.Il-velenu tar-rattlesnake tal-fossa tal-Lvant fih żewġ forom ta 'PLA2, imsejħa tip a u tip p PLA2 rispettivament.Id-differenza bejn dawn iż-żewġ tipi ta 'PLA2 hija aċidu amminiku wieħed biss, jiġifieri, il-glutamina f'molekula PLA2 waħda tinbidel b'aċidu glutamiku fil-molekula PLA2 l-oħra.Għalkemm ir-raġuni eżatta għal din id-differenza mhix ċara, huwa ġeneralment maħsub li hija relatata mad-deamination ta 'PLA2.Jekk PLA2 fil-velenu tal-viper Palestinjan jinżamm sħun mal-velenu mhux raffinat, il-gruppi tat-tarf fil-molekuli tal-enżimi tiegħu jsiru aktar minn qabel.Minn C PLA2 iżolat mill-velenu tas-serp għandu żewġ N-terminali differenti, u l-piż molekulari tiegħu huwa 30000. Dan il-fenomenu jista 'jkun ikkawżat mid-dimer asimmetriku ta' PLA2, li huwa simili għad-dimer simetriku ffurmat minn PLA2 fil-velenu tar-rattlesnake tad-djamant tal-Lvant u rattlesnake tad-djamant tal-punent.Il-kobra Asjatika hija komposta minn ħafna sottospeċi, li wħud minnhom mhumiex definiti ħafna fil-klassifikazzjoni.Pereżempju, dik li qabel kienet tissejjaħ is-sottospeċi tal-Kaspju ta’ Barra Cobra issa hija rikonoxxuta
Għandu jiġi attribwit lill-Cobra tal-Baħar Kaspju ta 'barra.Peress li hemm ħafna sottospeċi u huma mħallta flimkien, il-kompożizzjoni tal-velenu tas-serp tvarja ħafna minħabba sorsi differenti, u l-kontenut tal-isożimi PLA2 huwa għoli wkoll.Per eżempju, velenu cobra
Mill-inqas 9 tipi ta 'isożimi PLA2 ta' speċi r ^ ll instabu fi, u nstabu 7 tipi ta 'isożimi PLA2 fil-velenu tas-sottospeċi Kobra Kaspju.Durkin et al.(1981) studjaw il-kontenut PLA2 u n-numru ta 'isożimi f'veleni ta' sriep differenti, inklużi 18-il velenu tal-kobra, 3 veleni tal-mamba, 5 veleni tal-viper, 16-il velenu tar-rattlesnake u 3 veleni tas-serp tal-baħar.B'mod ġenerali, l-attività PLA2 tal-velenu tal-kobra hija għolja, b'ħafna isożimi.L-attività PLA2 u l-isożimi tal-velenu tal-viper huma medji.L-attività PLA2 tal-velenu tal-mamba u tal-velenu tar-rattlesnake hija baxxa ħafna jew l-ebda attività PLA2.L-attività PLA2 tal-velenu tas-serp tal-baħar hija wkoll baxxa.
F'dawn l-aħħar snin, ma ġiex irrappurtat li PLA2 fil-velenu tas-serp jeżisti fil-forma ta 'dimer attiv, bħas-rattlesnake rhombophora tal-Lvant (C. velenu tas-serp fih tip a u tip P PLA2, li t-tnejn huma komposti minn żewġ subunitajiet identiċi , u dimerase biss għandha
Attività.Shen et al.ippropona wkoll li d-dimer tal-PLA2 biss tal-velenu tas-serp huwa l-forma attiva tal-enzima.L-istudju tal-istruttura spazjali jipprova wkoll li PLA2 ta 'rattlesnake tad-djamant tal-Punent jeżisti fil-forma ta' dimer.Kompost pixxivoru
Hemm żewġ PLA differenti ^ Ei u E2 ta 'velenu ta' serp, li fihom 仏 teżisti fil-forma ta 'dimer, id-dimer huwa attiv, u l-monomeru dissoċjat tiegħu huwa inattiv.Lu Yinghua et al.(1980) studjaw aktar il-proprjetajiet fiżiċi u kimiċi u l-kinetika tar-reazzjoni ta 'E. Jayanthi et al.(1989) iżolaw PLA2 bażiku (VRVPL-V) mill-velenu tal-viper.Il-piż molekulari tal-monomeru PLA2 huwa 10000, li għandu effetti letali, antikoagulanti u edema.L-enzima tista 'polimerizza polimeri b'piżijiet molekulari differenti taħt il-kundizzjoni ta' PH 4.8, u l-grad ta 'polimerizzazzjoni u l-piż molekulari tal-polimeri jiżdiedu biż-żieda tat-temperatura.Il-piż molekulari tal-polimeru ġġenerat f'96 ° C huwa 53 100, u l-attività PLA2 ta 'dan il-polimer tiżdied b'żewġ
Ħin tal-post: Nov-18-2022